765.隐蔽、狡猾、善变(2/3)
我们还研究了MDSCs在外周血、脾脏和骨髓中的比例。仅在接种LLC细胞一周后，TB小鼠外周血中的MDSC百分比是无瘤小鼠的两倍(27.33±4.62vs.12.48±0.93，P<0.05)，3周后的MDSC百分比是无瘤小鼠的5倍(27.33±4.62vs.12.48±0.93，P<0.05)。TB小鼠外周血中PMNMDSCs的比例也增加，而MMDSCs的比例与肿瘤大小无关。
PDL1是肿瘤细胞、MDSCs、巨噬细胞和树突状细胞表达的最重要的检查点分子之一。为了确定TB小鼠MDSCs的PDL1表达是否与健康小鼠不同，我们通过流式细胞术测试了MDSCs的PDL1表达。结果表明，TME中MDSCs上PDL1的平均荧光强度（MFI）从在LLC细胞接种后的第一周386.8±100.9逐渐增加到第四周的1，068.0±121.8（P<0.01），这表明PDL1在我们模型中的MDSC中具有潜在作用。
在脾脏和骨髓中，随着肿瘤的发展，MDSCs的比例也显著增加，其模式与肿瘤组织和外周血中的MDSCs相同。此外，我们在TB小鼠中观察到明显的脾肿大，这与我们观察到的MDSCs在脾内聚集一致。
为了确定局部照射对肿瘤生长和MDSCs的影响，当肿瘤直径达到7.5时，我们使用大分割RT(20Gy/F)治疗皮下LLC肿瘤。放疗导致肿瘤进展延迟长达一周，在第7至第10天的最小体积约为5003，但此后肿瘤开始再生。根据放疗前后肿瘤生长曲线，我们选择放疗后第3天为再生前生长，放疗后1周为肿瘤体积最小时为再生开始，放疗后2周和3周为再生阶段。肿瘤组织苏木精伊红染色显示，与未治疗的肿瘤相比，放疗后的肿瘤中有更多的浸润性炎症细胞。随后的CD11b特异性免疫组化染色显示，大多数炎症细胞是CD11b髓系细胞，这表明局部照射可能导致MDSCs的积累。为了证实我们的假设，我们在局部照射后的不同时间点对总MDSCs和这两个亚群进行了流式细胞术分析。局部照射后，放疗后肿瘤浸润MDSCs的比例比未治疗肿瘤高2倍(ctrlvs.RT21.33±3.29vs.44.10±3.00，P<0.001)。PMNMDSCs与总MDSCs具有相同的增加趋势(ctrlvs.RT16.37±2.47vs.38.66±4.24，P<0.001)，而MMDSC比例保持在约0.1，且与肿瘤大小和治疗无关。外周血情况同肿瘤组织。
为了确定受照射肿瘤中PMNMDSC的逐渐积累是否有助于LLC肿瘤的再生长，或者这种积累是否仅仅是肿瘤生长的结果，使用抗Ly6G单克隆抗体来消耗MDSC.抗Ly6G抗体的应用显着降低了肿瘤部位和外周血中PMNMDSC的频率（P<0.05）。此外，用抗Ly6G抗体治疗大大延迟了照射后的再生，这表明PMNMDSC的募集对肿瘤再生至关重要。
虽然PMNMDSCs利用一系列机制来抑制抗肿瘤免疫反应，这涉及到许多免疫细胞和细胞因子，但对CD8T细胞的抑制无疑是最重要的。为了确定RT后PMNMDSCs诱导的免疫抑制是否依赖于CD8T细胞，我们通过流式细胞术评估了CD8T细胞的数量和功能。
如图3D所示，CD8T细胞的百分比随着照射从11.71±2.31下降到2.42±0.62(P<0.01)。PMNMDSC耗竭逆转了这种下降（RTantiLy6G抗体2.42±0.62vs.20.12±3.92，P<0.01）。为了更好地了解CD8T细胞浸润肿瘤部位的功能状态，我们测量了CD8T细胞内部和表面上IFNγ、CD28和PD1的表达。局部RT显着降低了CD8T细胞分泌IFNγ的比例，从33.064.53降至13.252.08，并增加了表达PD1的CD8T细胞的比例（ctrlvs.RT253.20±57.03auvs.538.80±98.76）au，P<0.05）。
CD28表达未观察到显着变化。当抗Ly6G抗体被给予辐照小鼠时，IFNγ分泌达到与未处理的LLC小鼠相同的水平（29.74±3.55），而与辐照小鼠进行比较抗Ly6G抗体处理后的PD1表达没有变化小鼠。因此，在这部分我们建议PMNMDSCs通过抑制CD8T细胞促进放疗后肿瘤的再生。PMNMDSCs不仅抑制了TME中CD8T细胞的数量，而且还抑制了其活性。
为了确定辐照诱导MDSCs的抑制机制，我们进行了免疫组化染色及iNOS和ARG1活性检测。肿瘤切片的免疫组化染色显示，局部RT增强了ARG1的表达，但没有增强iNOS的表达。ARG1活性测定表明，局部照射显著提高了ARG1的活性，从0.400.15U/L提高到3.780.39U/L((P<0.01)。相比之下，NO荧光标记的iNOS活性检测显示，辐照和未处理的肿瘤组织样本的荧光强度相似。
PDL1的表达是MDSCs的一种新型免疫抑制机
PDL1是肿瘤细胞、MDSCs、巨噬细胞和树突状细胞表达的最重要的检查点分子之一。为了确定TB小鼠MDSCs的PDL1表达是否与健康小鼠不同，我们通过流式细胞术测试了MDSCs的PDL1表达。结果表明，TME中MDSCs上PDL1的平均荧光强度（MFI）从在LLC细胞接种后的第一周386.8±100.9逐渐增加到第四周的1，068.0±121.8（P<0.01），这表明PDL1在我们模型中的MDSC中具有潜在作用。
在脾脏和骨髓中，随着肿瘤的发展，MDSCs的比例也显著增加，其模式与肿瘤组织和外周血中的MDSCs相同。此外，我们在TB小鼠中观察到明显的脾肿大，这与我们观察到的MDSCs在脾内聚集一致。
为了确定局部照射对肿瘤生长和MDSCs的影响，当肿瘤直径达到7.5时，我们使用大分割RT(20Gy/F)治疗皮下LLC肿瘤。放疗导致肿瘤进展延迟长达一周，在第7至第10天的最小体积约为5003，但此后肿瘤开始再生。根据放疗前后肿瘤生长曲线，我们选择放疗后第3天为再生前生长，放疗后1周为肿瘤体积最小时为再生开始，放疗后2周和3周为再生阶段。肿瘤组织苏木精伊红染色显示，与未治疗的肿瘤相比，放疗后的肿瘤中有更多的浸润性炎症细胞。随后的CD11b特异性免疫组化染色显示，大多数炎症细胞是CD11b髓系细胞，这表明局部照射可能导致MDSCs的积累。为了证实我们的假设，我们在局部照射后的不同时间点对总MDSCs和这两个亚群进行了流式细胞术分析。局部照射后，放疗后肿瘤浸润MDSCs的比例比未治疗肿瘤高2倍(ctrlvs.RT21.33±3.29vs.44.10±3.00，P<0.001)。PMNMDSCs与总MDSCs具有相同的增加趋势(ctrlvs.RT16.37±2.47vs.38.66±4.24，P<0.001)，而MMDSC比例保持在约0.1，且与肿瘤大小和治疗无关。外周血情况同肿瘤组织。
为了确定受照射肿瘤中PMNMDSC的逐渐积累是否有助于LLC肿瘤的再生长，或者这种积累是否仅仅是肿瘤生长的结果，使用抗Ly6G单克隆抗体来消耗MDSC.抗Ly6G抗体的应用显着降低了肿瘤部位和外周血中PMNMDSC的频率（P<0.05）。此外，用抗Ly6G抗体治疗大大延迟了照射后的再生，这表明PMNMDSC的募集对肿瘤再生至关重要。
虽然PMNMDSCs利用一系列机制来抑制抗肿瘤免疫反应，这涉及到许多免疫细胞和细胞因子，但对CD8T细胞的抑制无疑是最重要的。为了确定RT后PMNMDSCs诱导的免疫抑制是否依赖于CD8T细胞，我们通过流式细胞术评估了CD8T细胞的数量和功能。
如图3D所示，CD8T细胞的百分比随着照射从11.71±2.31下降到2.42±0.62(P<0.01)。PMNMDSC耗竭逆转了这种下降（RTantiLy6G抗体2.42±0.62vs.20.12±3.92，P<0.01）。为了更好地了解CD8T细胞浸润肿瘤部位的功能状态，我们测量了CD8T细胞内部和表面上IFNγ、CD28和PD1的表达。局部RT显着降低了CD8T细胞分泌IFNγ的比例，从33.064.53降至13.252.08，并增加了表达PD1的CD8T细胞的比例（ctrlvs.RT253.20±57.03auvs.538.80±98.76）au，P<0.05）。
CD28表达未观察到显着变化。当抗Ly6G抗体被给予辐照小鼠时，IFNγ分泌达到与未处理的LLC小鼠相同的水平（29.74±3.55），而与辐照小鼠进行比较抗Ly6G抗体处理后的PD1表达没有变化小鼠。因此，在这部分我们建议PMNMDSCs通过抑制CD8T细胞促进放疗后肿瘤的再生。PMNMDSCs不仅抑制了TME中CD8T细胞的数量，而且还抑制了其活性。
为了确定辐照诱导MDSCs的抑制机制，我们进行了免疫组化染色及iNOS和ARG1活性检测。肿瘤切片的免疫组化染色显示，局部RT增强了ARG1的表达，但没有增强iNOS的表达。ARG1活性测定表明，局部照射显著提高了ARG1的活性，从0.400.15U/L提高到3.780.39U/L((P<0.01)。相比之下，NO荧光标记的iNOS活性检测显示，辐照和未处理的肿瘤组织样本的荧光强度相似。
PDL1的表达是MDSCs的一种新型免疫抑制机
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